Parte 1: Cambio del diámetro interno de la columna y ajuste de la velocidad de flujo

Autor invitado: Dr. Jeff Layne

¡Hola a todos!

Aquí Jeff Layne, de vuelta con una serie de artículos, y esta vez volviendo a nuestros orígenes en el desarrollo de métodos. En esta nueva serie, vamos a estudiar el tema del diámetro interno de la columna dentro del contexto de las separaciones analíticas, no hablaremos de cromatografía preparativa (que daría por sí mismo para otra gran serie).

Recibimos muchas preguntas acerca de cómo el cambio del diámetro interno afecta la cromatografía, sobretodo en relación a LC-MS. Para contestar estas preguntas, vamos a usar una serie de aplicaciones de LC-MS que ilustran esta cuestión.

Para ilustrar los principios básicos, hemos hecho un simple estudio de LC-MS usando una muestra patrón conocida (17-alpha-OH-progesterone), e intentamos verificar los resultados usando una muestra más realista (panel de pesticidas). Por supuesto, esto es solo un ejemplo, y no debe ser representativo de cada aplicación, pero creo que ilustra los efectos básicos al cambiar el diámetro interno de la columna. Este trabajo se llevó a cabo usando un equipo de HPLC Agilent® 1200 acoplado a un espectrómetro de masas API 4000™ MS system (SCIEX).

Hay bastante materia que cubrir, por lo que voy a repartir los resultados en 3-4 artículos diferentes, así que mantente atento a los siguientes por venir.

¡Empecemos!

4.6 mm, 3.0 mm, 2.1 mm – muchas opciones. ¿Por qué es importante el diámetro interno?

La respuesta más sencilla a esta pregunta es que, al disminuir el diámetro interno, la respuesta de la altura de pico aumenta. La conclusión práctica de ello es que se pueden mejorar los límites de detección y cuantificación. Pero la respuesta es de hecho más compleja, debido al número considerable de otras variables que se suceden.  El cambio del diámetro interno de la columna tendrá efectos directos en diversos parámetros, incluyendo (pero no únicamente) la altura de pico, la proporción señal-ruido, la eficiencia media de la columna, la capacidad de carga de muestra, la sensibilidad ante la inyección de disolventes fuertes, presión, tiempos de retención de los analitos, uso de disolventes y/o generación de líquidos de desecho. El tema se complica porque también hay que considerar si se ajusta la velocidad de flujo al cambiar el diámetro interno de la columna, o si se mantiene constante.

Efectos de cambiar el diámetro interno de la columna en el escalado de la velocidad de flujo

Si aún no he conseguido convencerte de que soy un auténtico friki, la siguiente frase eliminará toda posible duda al respecto. En HPLC, cuando se pasa fase móvil a un flujo constante (por ejemplo 1 mL/min), la velocidad linear de la fase móvil atravesando la columna incrementará o disminuirá en relación al cambio transversal en el área superficial de la columna, y ya que la retención del analito será proporcional a la velocidad linear de la fase móvil, los tiempos de retención de los analitos también variarán al variar el diámetro interno de la columna. Para una mejor explicación de este principio, ver: chromatographyonline.com.

Podemos usar una manguera para explicar fácilmente este tópico tan complejo.  Imagina que tienes una manguera en un sofocante día de verano. Abres el grifo y el agua comienza a fluir por la salida de la manguera describiendo un arco sobre el césped. El flujo de agua se mide en litros por minuto y la cantidad dependerá de cuánto se gire el grifo. El arco de agua cae 1 metro por delante de ti y una gota de agua tarda 2 segundos en alcanzar ese punto. Esa es la velocidad linear del agua – distancia por unidad de tiempo – 1 metro en 2 segundos. Ahora, sin tocar el grifo, presionas levemente el final de la manguera con el dedo para bloquear parcialmente la apertura. Ese flujo constante de agua (litros por minuto) es forzado a través de una apertura más pequeña, y sale en un chorro más estrecho y disparada más lejos que antes. Ahora, con tu dedo bloqueando parcialmente el final de la manguera, el arco más estrecho de agua aterriza 2 metros delante de ti, pero sigue tardando 2 segundos en alcanzar ese punto. La velocidad linear del agua se incrementa de 1 metro / 2 segundos a 2 metros / 2 segundos debido a la disminución del diámetro de la manguera por efecto de tu dedo. ¡Voila! ¡Cromatografía de líquidos explicado con una manguera!

Lo mismo ocurre en tu columna de LC al cambiar el diámetro interno de la columna. Si mantienes el flujo de la bomba constante (e.g. 1 mL/min) y reduces el diámetro interno de la columna (por ejemplo, de 4.6 mm a 2.1 mm), esa fase móvil se ve forzada a través de un tubo de diámetro más pequeño y su velocidad linear a través de la columna aumenta. Así pues, cualquier analito que sea arrastrado por la fase móvil también se moverá más rápidamente a lo largo de la columna y eluirá antes.

Por ejemplo, en una columna de 4.6 mm de diámetro interno a un flujo de 1 ml/min, el analito X eluye a los 5 minutos. Si mantenemos el flujo constante y cambiamos a una columna de 2.1 mm de diámetro interno (e idéntica longitud), ese analito X eluirá antes, aproximadamente a 1 min (manteniendo constantes el resto de parámetros).

La respuesta de altura de pico también se incrementará al disminuir el diámetro interno de la columna, que es nuestro principal beneficio. De hecho, al cambiar de una columna de 4.6mm a una de 2.1mm de diámetro interno, debemos esperar un incremento de altura 5 veces mayor aproximadamente.

Para compensar ese cambio en tiempos de retención, podemos ajustar la velocidad de flujo para mantener la misma velocidad linear al variar el diámetro interno de la columna, resultando en tiempos de retención constantes (o casi) para los analitos, a la vez que nos beneficiamos de un incremento en la señal de respuesta.

Esto queda ilustrado en la Figura 1, que muestra el cromatograma de intercambio iónico para progesterona 17-Alfa-OH analizado en tres columnas con distinto diámetro interno (2.1 mm, 3.0 mm, & 4.6 mm) y velocidad de flujo ajustado (0.2 mL/min para la de 2.1 mm, 0.43 mL/min para la de 3.0 mm, y 1 mL/min para la de 4.6 mm). Se utilizó el mismo gradiente linear para cada columna (5-95% B en 5 minutos). Al ir disminuyendo el diámetro interno de la columna desde 50 x 4.6 mm (Figura 1.a) a 3.0 mm (Figura 1.b), la respuesta de la altura de pico es casi el doble, más o menos lo que cabría esperar basándonos en el cambio de diámetro interno de columna, y es un beneficio estupendo para el analista que busca incrementar la sensibilidad. Sin embargo, al cambiar el diámetro interno de columna de 3.0 mm a 2.1 mm (Figura 1.c), existe un incremento en la respuesta de la altura de pico, pero como se puede ver, es más modesto siendo solo 7% mayor que la columna de 3.0 mm.

El incremento observado en el cambio de 4.6 mm a 3.0 mm es consistente con los valores esperados, pero no se observan los mismos beneficios al cambiar de diámetro interno de 3.0 mm a 2.1 mm, donde se habría esperado doblar la altura de pico. No queda claro en el estudio si esta desviación del comportamiento esperado se debe a los efectos del volumen muerto del sistema, que provoca el ensanchamiento de banda, o a la naturaleza de la interfaz con el detector de MS. Podríamos obtener esta información acoplando el MS al sistema HPLC con un volumen muerto del sistema mucho menor, pero nos lo reservamos para otro estudio.

El mensaje importante a tener en cuenta es que sí que se observa un aumento en sensibilidad al cambiar a diámetros de columna menores. Sin embargo, este incremento es más llamativo al cambiar de 4.6 mm a 3.0 mm y el beneficio es mínimo en sensibilidad al cambiar el diámetro interno de 3.0 mm a 2.1 mm. Todo esto se ha conseguido utilizando nuestro sistema HPLC (un Agilent 1200 bien cuidado) y nuestro detector MS (API 4000), conectado con la cantidad mínima de tubos PEEK de diámetro interno de 0.005” (rojos) y bypaseando el termostatizador para minimizar el volumen muerto de la columna, y escalando el flujo para mantener constante la velocidad linear. Los datos sobre la altura de pico y la presión están recogidos en la Tabla 1.

Tabla 1. Respuesta de la altura de pico y presión del sistema para las tres columnas diferentes evaluadas con las velocidades de flujo ajustadas.

 

Ha sido mucha información que digerir, pero al menos hemos podido demostrar que disminuir el diámetro interno de la columna provoca un incremento en la respuesta de altura de pico en nuestra muestra patrón. En el siguiente artículo desarrollaremos un experimento similar, pero mantendremos la velocidad de flujo constante cambiando el diámetro interno de la columna.

¿Quieres mejorar tu análisis de HPLC? Echa un vistazo a nuestra Guía de resolución de problemas de HPLC para informarte sobre los últimos consejos y trucos en análisis de LC.

¡Volvemos al laboratorio!

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