Autor invitado: Zachary Woodward, especialista técnico
Recientemente revisamos cómo la relación de la fase puede acortar los tiempos de análisis sin perder resolución y quisiera explicar en detalle la importancia de la ecuación de la resolución en relación a la consistencia de las relaciones de la fase en el desarrollo del método con estos principios básicos. Esta será una gran reseña tanto para analistas nuevos como para los experimentados.
Una columna más corta por sí sola, mantendrá el factor de selectividad y capacidad (también conocido como “factor de retención”) de un análisis, pero mantener la relación de la fase mantendrá la eficacia del método original para no perder la resolución del método. Eso es bastante atrevido, pero valdrá la pena. Se considera que la ecuación de la resolución tiene tres términos, los cuales reflejan la eficacia, la selectividad y la capacidad de retención de su método. La eficacia es primordial para mantener la resolución de un método al pasar a una columna más corta, como lo demostraremos más adelante.
El impacto insignificante de una columna más corta en la selectividad y la capacidad de una columna se muestra en los dos cromatogramas hipotéticos a continuación, para los cuales el diámetro interno (DI) y el espesor de la película permanecen constantes. La Tabla 1 contiene las variables que debemos tener en cuenta.
Tabla 1: Variables de la resolución
Los dos cromatogramas hipotéticos siguientes son importantes para estos principios básicos de la resolución, ya que representan el efecto proporcional sobre el tiempo de retención y el volumen de la columna al llevar a cabo un método con una nueva columna que tiene exactamente la mitad de longitud que la columna original. El efecto final es que el “Término de selectividad” y el “Término de retención” de nuestra ecuación de resolución permanecen constantes, para lo cual se demuestran los cálculos en la Tabla 2.
Tabla 2: Determinación de la selectividad y la retención
El uso de una columna más corta por sí sola reducirá en realidad el número de platos teóricos disponibles, como resultado de que los analitos tendrán menos oportunidades de interactuar con la fase estacionaria en una columna más corta. Esto se demuestra en el segundo cromatograma, en el que los picos mantienen su amplia forma a pesar de eluir con anterioridad, lo que reduce finalmente la resolución entre nuestros picos.
La consideración importante consistirá en reducir el DI y el espesor de la película de manera acorde para mantener la relación de la fase, para aumentar la eficacia de la columna (N) y, en última instancia, devolver nuestra resolución al valor del método original. Un DI más estrecho aumentará la frecuencia de las interacciones entre un analito y la fase estacionaria, mientras que una película más delgada aumentará la tasa de transferencia de masa a medida que el analito hace la transición hacia y desde la fase estacionaria. El DI y el espesor de la película se reducen en el tercer cromatograma hipotético, para el cual los picos de ambos analitos son mucho más estrechos para proporcionar un mayor nivel de resolución entre los dos picos.
La eficacia (N) representa la anchura del pico y las oportunidades de interacción de un analito con la fase estacionaria. El cálculo de la eficacia tiene en cuenta la anchura del pico y su duración de retención. Un pico que eluye con anterioridad debe tener una amplitud muy estrecha para demostrar un alto nivel de eficacia y beneficiar la resolución de ese pico de los analitos vecinos.
Existen trucos, tanto en GC como en LC, para mantener la eficacia mientras se acorta una columna. En la cromatografía de gases(gas chromatography, GC) se mantiene la relación de fase mientras se reduce tanto el DI como el espesor de la película, para aumentar la frecuencia y la velocidad de las interacciones entre los analitos y la fase estacionaria. Durante la cromatografía líquida(liquid chromatography, LC), las partículas más pequeñas aumentan la frecuencia de interacción, mientras aumenta la velocidad a la que los analitos se transfieren dentro y fuera de la partícula y la fase estacionaria asociada. Evaluaremos cómo afecta esto a la LC en la próxima parte de esta columna.
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