buffers in mobile phase

Autora invitada: Namrata Saxena, Especialista técnica

Hemos explicado por qué el pH es fundamental en el desarrollo de la fase móvil, junto con sus efectos sobre la cromatografía e ionización de analitos en el primer capítulo de nuestra serie de blogs sobre la fase móvil. Ahora comentaré la importancia y el papel de elegir los tampones químicos correctos en la fase móvil.

Definición del tampón químico

La definición más sencilla de tampón químico es: una solución que puede resistir el cambio en el pH al añadirle pequeñas cantidades de ácido o de base. Por definición, los tampones químicos pueden ser de dos tipos: tampón químico ácido o básico.

Tampón químico ácido:

Un tampón químico ácido es una mezcla de un ácido débil y una sal con una base fuerte, por ejemplo.

Tampón de acetato sódico = CH3COOH + CH3COONa, rango de tampón químico 3,76 ~ 5,76

Tampón químico básico:

De forma similar, un tampón químico básico es una mezcla de una base débil y una sal con un ácido fuerte, por ejemplo.

Tampón de cloruro de amonio = NH4OH + NH4Cl, rango de tampón químico 8,24 ~ 10,24

Capacidad de tamponado

La capacidad de tamponado es la capacidad del tampón químico para resistir el cambio en el pH y es directamente proporcional a la concentración molar de la sal del tampón químico y su correspondiente ácido o base. Cuanto más cerca esté el pKa del tampón químico del pH deseado de la fase móvil, mayor será su capacidad de tamponado. Por ejemplo, si algún analito ácido tiene un pKa de 4,5, la necesidad del pH de la fase móvil para mantenerlo en estado desprotonado será de aproximadamente 2,0, y en este intervalo de pH el tampón químico adecuado será un tampón químico de fosfato con un pKa de 2,1 y un intervalo eficaz de pH de 1,1 – 3,1.

Necesidad de tampones químicos

Necesitamos tampones químicos para controlar y mantener el pH. El pH es un factor muy variable, puede cambiar muy fácilmente, incluso cuando la solución se deja reposar durante toda la noche, con ayuda del dióxido de carbono, o ácidos volátiles, como el ácido trifluoroacético (Trifluoroacetic acid, TFA), y puede evaporarse con el tiempo.

Uno de los puntos importantes que debe tenerse en cuenta es que, durante una prueba cromatográfica, si el pH del diluyente de la muestra no está controlado, el pH final de la muestra inyectada en el cabezal de entrada de la columna puede ser muy diferente al pH original de la solución de la fase móvil. Esto dará lugar a problemas como distorsión de picos, cambios de retención e incluso problemas de resolución en algunas separaciones críticas. Esto será especialmente cierto cuando se utiliza un volumen de inyección de muestra grande o cuando se utiliza una concentración muy grande o muy baja de tampón químico para ajustar el pH de la fase móvil. Por lo tanto, con el fin de mantener el pH tan estable como sea posible, se recomienda una adición de tampón químico no solo en la parte acuosa de la fase móvil, sino también en el diluyente de muestra.

Funcionamiento del tampón químico

En una solución de tampón químico siempre existe un equilibrio entre el disolvente débil y su correspondiente ácido o base conjugada. Por ejemplo, en este caso hemos logrado un equilibrio entre el ácido débil y su base conjugada.

HA + H2O ⇋ [H3O+] + [A]

Cuando se añade un ácido o base a esta solución, el equilibrio puede cambiar a la derecha o la izquierda.

Y para poder recuperar ese estado de equilibrio, se utilizará el ácido o base añadidos para mantener la concentración de iones H+ y OH. Por lo tanto, el equilibrio permanece estable en la solución y el ácido o la base añadidos no serán eficaces a la hora de cambiar el pH de dicha solución. En otras palabras, los iones añadidos de H+ u OH son más o menos neutralizados cuando entran en contacto con una solución tamponada. Por lo tanto, si la solución no está tamponada, no habrá equilibrio y los iones añadidos de H+ u OH pueden disminuir o aumentar fácilmente el pH de la solución.

Selección del tampón químico

  • La selección del tampón químico depende principalmente del pH deseado de la fase móvil, la cual, a su vez, depende del valor de pKa del analito. Por lo tanto, preferiblemente debe elegir un tampón químico que tenga un valor de pKa lo más cerca posible del valor requerido de pH de la fase móvil.
  • Compatibilidad con el detector, especialmente cuando trabaja con Masas como detector. La precondición para trabajar con Masas es que los analitos que salen de la columna deben ser volátiles para poder generar una suficiente cantidad de iones en la fuente iónica para ser detectados por el detector de Masas. Por este motivo, los tampones químicos inorgánicos como las sales de fosfato no funcionan con el espectrómetro de Masas. Es una práctica común añadir modificadores en la LC-MS, con el objetivo de mejorar la señal de analitos o suprimir de forma selectiva la señal de un compuesto en particular en una mezcla. Por lo tanto, los tampones o aditivos químicos utilizados con el Espectrómetro de Masas siempre deben ser volátiles como, por ejemplo, las sales de amonio, el ácido fórmico y la dietilamina o trietilamina son los aditivos más comunes para trabajar con el detector de Masas.
  • Otro punto importante para tener en cuenta al seleccionar el tampón químico correcto es su límite de radiación UV, especialmente cuando funciona en longitudes de onda inferiores. Algunos tampones químicos podrían tener una absorbencia en las longitudes de onda más bajas, que interfiere en el intervalo de absorbencia de los analitos y también pueden reducir la sensibilidad del detector, que será visible en forma de ruido inicial.
  • La solubilidad de los tampones químicos es un factor importante; al elegir el tampón químico correcto, la solubilidad de las sales del tampón químico disminuye al cambiar el contraión en el orden anterior.

NN4 < K < Na

  • A veces, al trabajar con analitos ácidos o básicos no siempre se usa un tampón químico, y un pequeño porcentaje de ácidos o bases como el TFA, el ácido fórmico y el hidróxido de amonio son suficientes para neutralizar las especies iónicas en las muestras. Estos aditivos de fase móvil se llaman modificadores del pH y solo pueden funcionar de manera efectiva en sus valores específicos de pKa/pKb.

La figura a continuación categoriza los aditivos o tampones químicos más comunes utilizados para mantener/controlar el pH a diferentes valores.

la fase móvil.

A continuación se muestra la lista de tampones químicos utilizados con frecuencia en la cromatografía líquida:

 la fase móvil.

Instrucciones generales para usar tampones químicos

  • Utilice siempre tampones químicos de grado cromatográfico de alta pureza para preparar las soluciones de la fase móvil.
  • Se recomienda filtrar las soluciones de tampón químico/fase móvil con un filtro de 0,45 µ antes de usarlo en sistemas LC.
  • La temperatura afecta directamente la ionización y a su vez el pH de una solución, por lo que se debe mantener la temperatura incluso mientras se prepara un tampón químico porque en última instancia puede cambiar el pH.
  • La concentración del tampón químico está directamente relacionada con la polaridad y la ionización en la fase móvil, así que se debe elegir la concentración del tampón químico de forma inteligente. Entre 25 y 50 Mm es un buen punto de partida para la concentración del tampón químico al desarrollar un nuevo método.
  • Mida siempre los tampones químicos por peso (gravimétricamente) en vez de volumétricamente, empiece con la concentración más baja requerida, ya que las cantidades altas de tampón químico se pueden depositar dentro de la columna y las bombas de HPLC, y provocar contrapresiones superiores.
  • El aumento de la concentración del tampón químico mejora la forma y eficacia máximas, pero también puede dar lugar a cambios en la selectividad y, de nuevo, las cantidades más altas de sales de tampón químico se depositarán dentro de las bombas y las columnas.
  • Ajuste siempre el pH solo con la parte acuosa de la fase móvil para ser coherente y preciso con la medición del pH.
  • Intente siempre preparar soluciones de tampón químico frescas, las sales de tampón pueden dar lugar a crecimiento microbiano en las soluciones acuosas, lo que dará resultados cromatográficos falsos, además, la Trietilamina y el ácido Trifluoroacético se degradan  con el tiempo y su límite UV aumenta.
  • Los tampones químicos de citrato pueden corroer los tubos de acero inoxidable y las piezas del sistema de HPLC durante períodos prolongados de contacto; asegúrese de lavar exhaustivamente el sistema de HPLC y la columna para que queden libres de tampones químicos de citrato antes de su almacenamiento.
  • En general, los tampones químicos no tienen un efecto directo significativo en los tiempos de retención de analitos, excepto cuando se producen interacciones secundarias con analitos ionizables (p. ej., interacciones secundarias con silanol).
  • Cuando se usa el ácido Trifluoroacético como tampón químico, funciona como un excelente agente de par iónico y puede alterar drásticamente la retención de analitos cuando se usa en concentraciones equivocadas.
  • Sin duda, los aditivos y tampones químicos son importantes para lograr la selectividad y eficacia deseada en la cromatografía de fase reversa, pero también son dañinos para las columnas si se permite que permanezcan en su interior. Por lo tanto, se recomienda eliminar estos aditivos de la columna, especialmente antes de guardar la columna a medio o largo plazo. La contrapresión alta, los resultados irreproducibles, la asimetría mala y la pérdida de retención son algunos de los signos de contaminación y degradación de la columna debido a estos aditivos.
  • Dado que los tampones químicos son sales, y las sales se pueden eliminar con agua, un enjuague exhaustivo con agua puede eliminar fácilmente los tampones químicos de la columna. Aplicar un poco de temperatura durante la limpieza de las columnas también ayuda.
  • Al lavar las fases hidrofóbicas, asegúrese de mantener al menos de un 10 % a un 15 % de orgánico en el solvente de lavado para garantizar que no habrá un colapso hidrofóbico dentro de la columna; sin embargo, puede correr agua al 100 % en las fases que sean acuosas estables.

El tampón químico está justificado como uno de los componentes críticos de la fase móvil, así que debe elegirlo adecuadamente.


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