Autora invitada: Genevieve Hodson, Especialista técnica

La práctica habitual es dejar las Columnas de LC a “temperatura ambiente”, o condiciones de temperatura ambiente, al ejecutar métodos analíticos rutinarios. ¿Entonces por qué las empresas de cromatografía le indican que no lo haga? Recubrir la columna con un horno y configurar la temperatura de los métodos a 25 °C en la columna, que la mayoría de los científicos están de acuerdo que es la temperatura ambiente, puede parecer más trabajo que dejar la columna expuesta a las condiciones de temperatura ambiente del laboratorio. Y si está buscando resultados reproducibles, esto es obligatorio.

Por ejemplo, la temperatura ambiente en un Laboratorio de calidad en Texas durante el verano, cuando el AC está encendido, puede hacer que el DMSO congele sólidos y que los químicos tengan que usar camisetas bajo sus batas de laboratorio, ¡pero es muy diferente cuando el AC se daña y usted debe realizar los estudios de estabilidad del horno en productos farmacéuticos que se encuentran en los viales! Esto sería un intervalo de Tª entre 19 °C a 37 °C, los cuales no se conocen en Texas. Un cambio de 15 °C puede tener grandes consecuencias sobre la reproducibilidad de los métodos y la vida útil global de las columnas. ¿Pero por qué? Sé que se está haciendo esa pregunta; ¡así que hablemos al respecto!

Reproducibilidad

Para los bioquímicos que están leyendo esto, vamos a visitar el viejo territorio de la termodinámica (si creían que ya habían terminado con la clase de física y química, ¡se equivocaron!). A medida que cambia la temperatura, la termodinámica dentro de la columna entre la fase estacionaria y la fase móvil se ve afectada directamente. Ejecutar un método a temperaturas variables puede afectar el factor de capacidad de los analitos (k), o el tiempo durante el cual se conservan los analitos en la columna. A continuación se muestra un gráfico del factor de capacidad aparente frente a la temperatura para algunos analitos teóricos.

Representación del factor de capacidad aparente (k) frente a temperatura

A temperaturas elevadas, existe un aumento en la energía cinética tanto de la fase móvil como de los analitos. El aumento de la energía cinética de los analitos los calentará y podría alterar la unión intermolecular que es el mecanismo de separación entre los analitos y la fase estacionaria..  Muchas veces esto provoca que todos los analitos salgan antes de tiempo de la columna, lo que provoca una reducción en el tiempo de retención. Por lo general, esto es más perceptible con cambios de temperatura grandes; en el ejemplo a continuación, la temperatura aumenta a intervalos de 20 °C.

Se podrían observar cambios en la temperatura de solo unos pocos grados Celsius que afecten solo a un analito específico en un cromatograma. En este caso, es probable que la pequeña diferencia de temperatura sea suficiente para impedir una interacción favorable con la fase estacionaria o con la fase móvil. Se puede ver en las muestras, ya que solo un analito cambia de retención en comparación con los demás, que mantienen sus tiempos de retención. Como es difícil predecir qué analito, si es que existe, podría verse afectado y cambiar en la retención debido a las pequeñas fluctuaciones de temperatura, la mejor práctica es mantener una temperatura constante encendiendo el calentador de la columna con la cubierta del calentador de la columna puesta.

Los oligonucleótidos proporcionan un ejemplo de temperaturas más altas que causan una reducción general en el tiempo de retención. Teniendo en mente la estructura 3D de esta clase de compuestos, pensemos en lo que ocurre cuando la temperatura cambia y se despliegan parcialmente. El despliegue parcial podría exponer a los grupos hidrofóbicos que pueden haber sido enterrados anteriormente, haciendo que el oligo se retenga más en la columna.  Y a la inversa, el despliegue podría exponer a los grupos hidrofílicos, provocando la retención opuesta. Se ha publicado una maravillosa Nota técnica sobre esto, referenciada aquí:

Limitaciones en las columnas

Las temperaturas también pueden afectar la vida útil global de las columnas. El medio/la fase de la columna es lo que impulsa la especificación de la temperatura máxima.

La estabilidad de temperatura de una columna puede diferir dependiendo del disolvente y tampón químico que se utilicen. Puede encontrar un ejemplo en la siguiente tabla para nuestra Columna marca Luna Omega. Existe una diferencia notable en la comparación de la C18 con la Polar C18 debido a pequeñas diferencias en el enlace de las fases. Para la mayoría de las columnas de fase reversa, de 60 °C a 90 °C es el intervalo de temperatura máxima más frecuente.

Las temperaturas elevadas en condiciones ácidas proporcionan condiciones termodinámicas favorables para la hidrólisis del ligando unido a la sílice. La hidrólisis se observa a medida que los tiempos de retención cambian más pronto debido a que hay menos fase para proporcionar interacciones en la fase estacionaria para los analitos. Se produce una pérdida de resolución antes que el cambio global en la retención. Es frecuente ver que la resolución inicial desaparece o que los picos se fusionan, en comparación con una nueva columna con la misma fase. La mejor práctica es no dejar columnas en el horno cuando está encendido y no dejar solvente circulando por el sistema. La mayoría de las fases móviles tienen algo de orgánica, que se evaporará más rápido.

Si tiene alguna pregunta adicional sobre la temperatura de la columna u otras preguntas cromatográficas, póngase en contacto con nuestros Especialistas técnicos, como Genevieve, a través de nuestro servicio gratuito de chat online– Chatear ya.

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