Descripción general: este consejo técnico describirá la cromatografía de interacción hidrófila (o cromatografía líquida de interacción hidrofílica, HILIC) como un mecanismo de retención alternativo que es particularmente eficaz para la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS). La HILIC utiliza altos niveles de disolvente orgánico para eluir los compuestos polares, lo que ayuda a mejorar la eficacia de ionización durante la LC-MS.

Los candidatos a fármacos modernos presentan muchos desafíos cromatográficos, ya sea en la detección o resolución de una impureza coeluyente. Una de las dificultades más comunes a la que se enfrentan es la retención y resolución de compuestos polares que no se pueden analizar por LC en condiciones típicas de fase reversa C18.

Muchas fases estacionarias de HPLC de fase reversa tradicionales no proporcionan una retención adecuada de muchos de los compuestos polares, cada vez más numerosos, que se analizan por HPLC. Estos compuestos a menudo no se retienen en el volumen muerto de la columna, se retienen tan pobremente que su forma de pico se ve comprometida o coeluyen con otros picos mal retenidos. Los picos de elución temprana también eluyen en una zona de supresión de iones que es problemática para las personas que utilizan instrumentos de LC-MS.

Consejo: la HILIC funciona reteniendo los compuestos polares en una capa rica en agua que se forma en la superficie de la partícula de sílice como resultado de una fase estacionaria polar (Fig.1).

El acetonitrilo (metil cianuro, MeCN) es el disolvente débil durante la HILIC y el tampón de amonio es el disolvente fuerte. Las sales de amonio son críticas como contraión ya que facilitan la formación de la bicapa crítica para la separación que se muestra en la Figura 1.

Una fase estacionaria rica en polos (ingles porfa) atrae una capa rica en agua a su superficie, lo que favorece la retención de los compuestos polares en la fase estacionaria. Los compuestos polares se eluyen a medida que aumenta la cantidad de agua en la parte móvil de la columna. Esto interrumpe la retención de analitos polares a lo largo de la fase estacionaria polar para inducir la elución.

Es importante que equilibre por completo su columna HILIC antes del uso para asegurarse de que esta capa rica en agua haya tenido el tiempo adecuado para formarse. Si esto no sucedió, no verá una retención constante de su compuesto o la solidez de su método.

Hemos mencionado el uso de tampones de amonio y existen varios otros factores dentro de un método de HILIC que también son críticos para su éxito.

El primero es la selectividad, para la cual la columna correcta es clave. Al igual que con las columnas de fase reversa, existen muchas fases estacionarias diferentes para la cromatografía HILIC y cada una ofrece diferentes perfiles de selectividad y beneficios. Le recomendamos que siempre se esfuerce por examinar tres fases diferentes para determinar cuál ofrece la mejor selectividad para su aplicación.

Entre los tipos de fases estacionarias utilizadas en HILIC que podría considerar se incluyen las siguientes:

  • sílice no derivatizada como Kinetex HILIC
  • fases diol como Luna HILIC
  • fases NH2
  • compuesto iónico o zwitteriónico

Es importante utilizar el MeCN en la fase móvil como componente orgánico. Los disolventes próticos como el metanol interrumpirán esta formación de bicapa que analizamos anteriormente. La cantidad de componente orgánico también es importante ya que, si es un porcentaje demasiado alto en el punto de partida del gradiente inicial, complicará y prolongará el equilibrio de la bicapa. Las condiciones ideales del método inicial deben ser 90 % orgánicas.

El perfil de gradiente debe ser de 90 % MeCN a 50 % cuando sea posible. Esto asegura que la bicapa esté completamente equilibrada al comienzo del gradiente. Si se requieren condiciones superiores al 50 % del tampón para eluir el compuesto, es probable que el método no sea el más adecuado para la HILIC, y podría ser una mejor opción una fase estacionaria de tipo polar C18.

Deberá volver a equilibrar la bicapa después de cada ejecución del gradiente. Cuanto mayor sea el porcentaje de tampón al final del gradiente, más tiempo llevará este proceso de reequilibrio. El reequilibrio incompleto del tampón dará lugar a una mala reproducibilidad y a una falta de robustez del método.

El último parámetro que debe considerar cuidadosamente es el pH. Deben examinarse al menos 2 pH diferentes y, por lo general, sugerimos un pH de 3,2 con formiato de amonio y de 5,8 con acetato de amonio. Diferentes pH pueden conducir a selectividades significativamente diferentes (Fig. 2).

La HILIC es una herramienta muy útil para promover la retención de los compuestos polares. El método puede ser una forma desafiante de crear robustez, pero con cuidadosas elecciones de fase móvil y parámetros de método, puede conducir a separaciones exitosas para fiscalizar compuestos.

La información de este artículo se extrajo de la nota técnica de Phenomenex: “Métodos analíticos de ingeniería exitosos utilizando HILIC como un mecanismo de retención alternativo.”

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