Este artículo se centra en la miniaturización de la columna de cromatografía líquida y explora los numerosos beneficios y desafíos que puede traer esta herramienta analítica.

Autora: Roxana Eggleston-Rangel

Si bien la espectrometría de masas combinada con la cromatografía líquida ha demostrado ser una herramienta poderosa en en el área del descubrimiento de ómicos (proteómica, lipidómica, metabolómica, alimentómica y glicómica), la investigación ómica a menudo se ve desafiada por la naturaleza compleja de sus muestras. La identificación y cuantificación de moléculas de interés puede resultar particularmente difícil al tratar con pequeñas cantidades de muestras, pequeños volúmenes y matrices de muestras complejas (biofluidos y análisis de células únicas).  La miniaturización de la columna de cromatografía líquida puede superar con éxito estos desafíos. Reducir el diámetro interno (DI) de la columna da como resultado una reducción en la dilución cromatográfica y una mayor sensibilidad, lo que permite obtener muestras de MS/MS más eficientes y, por lo tanto, u­na mayor cantidad de identificaciones de moléculas.

Aunque no hay dudas de que la LC-MS es una herramienta poderosa en la investigación ómica, a menudo también se ve desafiada por lo complejas que son sus muestras. Los biomarcadores metabólicos tienden a estar presentes en cantidades extremadamente bajas en matrices biológicas que contienen altas concentraciones de otros compuestos y contaminantes, lo que hace que estas matrices sean extremadamente complejas5. Por ello, la búsqueda de biomarcadores metabolómicos puede verse obstaculizada al usar el LC-MS de flujo analítico (Tabla 1). La LC-MS analítica tiende a favorecer la detección de metabolitos ya presentes a una concentración alta, lo que se debe en parte a la difícil ionización, que requiere el uso de altas temperaturas de fuente de espectrómetro de masas, altos voltajes y gases de nebulización. De manera similar, el análisis lipidómico a menudo utiliza sales no volátiles que exhiben una evaporación del solvente y una eficacia de ionización deficiente. La ionización6,7 no es el único desafío; la cantidad de la muestra puede ser un factor limitante importante, como en el caso de la proteómica biomédica y de descubrimiento, que maneja muestras pequeñas, tales como células únicas, biopsias y tejidos que no proporcionan los millones de células o los cientos de microgramos de proteínas que se necesitan en los flujos de trabajo de proteómica comunes.1

La miniaturización de la columna de cromatografía líquida puede superar con éxito estos desafíos. Reducir el diámetro interno de la columna produce una reducción en la dilución cromatográfica.  Esta dilución ocurre cuando se inyecta una cantidad de muestra en la columna y se diluye mediante los solventes circundantes. En este caso, menos solvente significa menos dilución cromatográfica, que es el resultado de usar un menor diámetro interno de columna. La reducción en la dilución cromatográfica produce un aumento en la sensibilidad a los iones, lo que permite obtener muestras de MS/MS más eficientes y, por lo tanto, una mayor cantidad de identificaciones de moléculas.2

Figura 1. Aumento de la sensibilidad (f) como resultado del uso de una columna de LC miniaturizada con un diámetro interno más pequeño.

Teóricamente, la disminución del ID de la columna de 2,1 mm a 0,300 mm da como resultado una concentración de muestra 49 veces superior, que debería traducirse en un aumento en la sensibilidad de 49 veces .8,9 En realidad, este no siempre es el caso. La sensibilidad se mide por la intensidad iónica, que depende de otros factores además de la concentración de la muestra, como la naturaleza de ionización del analito y los parámetros del equipo de LC-MS y de la fuente del emisor. No obstante, como se muestra en la Figura 2, la escala descendente del ID de la columna de 2,1 a 0,300 mm puede provocar un aumento en la sensibilidad de casi 10 veces para 50 ng de oxicodona.

Figura 2. Cromatograma iónico extraído de oxicodona usando flujo analítico (azul) y microflujo (rosado).

Además, calculado mediante la siguiente ecuación [1]f 2=f1(d2/d1)2, donde flujo y = ID de la columna y f2>f1 y d2>d1, una disminución en el diámetro interno de la columna también requiere una disminución en el flujo  para mantener la misma velocidad (o similar) velocidad lineal; con una reducción en el flujo se produce un aumento en la eficacia de ionización. En la espectrometría de masas se utiliza ionización por electrospray (electrospray ionization, ESI) cuando se utilizan flujos de LC analíticos (Tabla 1). El flujo analítico produce un gran volumen de líquido en el emisor MS, y el gran volumen de líquido hace que la eficacia de la ionización sea un problema. En consecuencia, la ESI utiliza altos voltajes, altas temperaturas y altas cantidades de gases de nebulización para producir iones en fase gaseosa a partir de estas grandes gotas de líquido cargado.

Tabla 1. Flujos típicos y cargas de muestras utilizadas en la cromatografía líquida de acuerdo con el tipo de columna (DI).

Tipo de columna Diámetro interno (DI) de la columna Índices de flujos habituales Carga de muestra típica
Nano LC 50-75 µm 200-500 nl/min 100-300 ng
Micro LC 0,15-0.5 mm 1,0-50 µl/min 1-10 μg
Análisis a bajo flujo 1,0-2,1 mm 0,02-0.1 ml/min 10-50 μg
Analítico 2,1-8 mm 0,1-3,0 ml/min 0,1-1,5 mg
Semipreparativa 9-15 mm 5-10,0 ml/min 1-10 mg
Preparativa 16-100 mm 20-250 ml/min 20-250 mg

La reducción del flujo disminuye el tamaño de las gotículas en el emisor de MS y aumenta la concentración de analitos cargados (Figura 3). Normalmente, se aplica un voltaje de 1,5-3 kV, lo que permite que esos analitos pasen de la fase líquida a la fase gaseosa sin necesidad de gases nebulizantes, altas temperaturas y altos voltajes que tienden a obstaculizar la ionización de los analitos presentes en bajas cantidades. En comparación con la ESI utilizada en el flujo analítico, nano-ESI (NSI) genera un aerosol estable que puede proporcionar una mejor sensibilidad de los analitos que contienen cantidades no deseadas, pero tal vez necesarias, de sales, como por ejemplo, en el caso del descubrimiento en lipidómica,6 pero, sobre todo, proporciona una mejor sensibilidad en general.  

Figura 3. Representación de la ionización analítica frente a la ionización de flujo bajo. La NSI permite la concentración de gotas cargadas que pueden pasar fácilmente a la fase gaseosa e ingresar por la entrada del espectrómetro de masas de manera más eficaz, en comparación con las partículas cargadas con ESI más diluidas.

La miniaturización de la columna reduce la dilución cromatográfica y mejora en gran medida la eficacia de la ionización; esta combinación hace que el nanoflujo sea una técnica altamente deseable en el mundo de la ómica cuando solo hay bajas cantidades de muestra disponibles o se necesita una mejor ionización debido a la adición de solventes o sales no volátiles. Además de una mayor sensibilidad, una mayor relación señal-ruido (S/N) y un menor límite inferior de cuantificación (LLOQ), también disminuye el consumo de solventes, lo que reduce los costos y los beneficios para el medioambiente. Al mismo tiempo, con una reducción en el flujo, en ocasiones existe la necesidad de aumentar la longitud del gradiente. Un aumento en la longitud del gradiente reduce el rendimiento de la muestra. No obstante, cuando se busca rendimiento, sensibilidad y solidez de la muestra, el microflujo es una gran opción intermedia (Figuras 4 y 5). La Figura 5 ilustra el aumento de la sensibilidad alcanzado por la miniaturización de la columna cuando se reduce el ID de la columna de 0,300 mm (microflujo) a 0,075 mm (flujo nano).

Figura 4. Relación entre el flujo nano, micro y analítico.

Figura 5. La intensidad de iones aumenta al disminuir la escala de la columna de Micro (naranja) a Nano (azul) para cada uno de los 20 péptidos sintéticos (10 fmol de cada uno en la columna), eje x = péptido m/z.

A pesar de los numerosos beneficios de la cromatografía de flujo bajo, también hay algunas consideraciones a tener en cuenta. Al optar por el nanoflujo y el microflujo, se debe considerar y tener cuidado con el volumen de permanencia. Este es el volumen que se necesita desde el momento en que se forma el gradiente hasta el momento en que llega a la parte superior de la columna y es responsable de las demoras del gradiente. En el caso del flujo analítico, un volumen de permanencia de 5 μl no provoca una demora notoria del gradiente, pero el mismo volumen de permanencia cuando se opera a 250 nl/min causaría una demora del gradiente de aproximadamente 20 min.  Para reducir este volumen, la instrumentación de bajo flujo debe estar conectada con tubos capilares de 10 a 75 μm de DI.

El volumen de columna adicional se refiere al volumen encontrado entre el inyector y el detector, y es responsable de efectos de mezcla que disminuyen la eficacia observada, ya que agregan una ampliación adicional de la columna. Se puede encontrar en cualquiera de los componentes del sistema de LC (asiento de la aguja, fritas, tubos, conexiones) y puede contribuir al ensanchamiento del pico. Para minimizar los efectos de volumen de columna adicional, la cromatografía de bajo flujo utiliza sistemas de LC miniaturizados en los que cada uno de sus componentes transporta solo un volumen pequeño en comparación con los sistemas de LC convencionales. Además, para minimizar o evitar efectos adicionales en el volumen de la columna, cada conexión debe inspeccionarse regularmente para detectar fugas, lo que puede llevar mucho tiempo. Una fuga en el ámbito del flujo bajo casi siempre es indetectable a simple vista y requiere un operador altamente experimentado para detectarla.

Además, la obstrucción y sobrecarga de la columna también deben considerarse, ya que sólidos microscópicos y, en el caso de la proteómica, proteínas no digeridas, pueden obstruir la columna de pequeño ID y volverla inutilizable. Por lo tanto, el usuario debe tener cuidado de limpiar adecuadamente la muestra antes de la inyección o de usar una trampa (columna previa) para eliminar los contaminantes no deseados y evitar que alcancen la columna miniaturizada. Al usar una trampa, la trampa está alineada con la columna, la muestra se carga en ella mientras que las partículas no deseadas se desechan.  Una vez que la muestra se concentra en la trampa y está libre de contaminantes, se dirige hacia la columna para su análisis. El uso de una columna trampa puede ayudar a evitar la contaminación de la nano o microcolumna y extender la vida útil de la columna.

La miniaturización de columnas puede presentar muchos desafíos, pero no hay dudas de que los beneficios compensan con crecer estos desafíos. El aumento en la intensidad iónica provocado por la cromatografía de bajo flujo ha hecho posible identificar biomarcadores para la investigación clínica10; identificar miles de proteínas usando menos de 2 ng de proteína y cientos en células únicas11, así como metabolitos.5 Los avances biomédicos y los nuevos conocimientos científicos fundamentales obtenidos de las separaciones de micro y nano flujo hacen de esta una poderosa técnica analítica.

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Acerca de la autora

Roxana Eggleston-Rangel es científica de aplicación en Phenomenex. Obtuvo su título de grado y maestría en Química y Bioquímica en California State University de Los Ángeles, EE. UU.  Roxana es fanática de la LC-MS/MS y actualmente trabaja en el desarrollo de métodos de LC-MS/MS con un enfoque en las separaciones de nanoflujo y microflujo.

Referencias

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  2. Shishkova E, Hebert AS, Coon JJ. Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Syst. 2016 Oct 26;3(4):321-324. doi: 10.1016/j.cels.2016.10.007. PMID: 27788355; PMCID: PMC5448283.
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