Autor invitado: James Turner, experto técnico
Como técnico especialista, a menudo me preguntan sobre el cribado quiral y el desarrollo de métodos, como las siguientes cuestiones:
“¿Cómo puedo seleccionar la fase estacionaria quiral correcta para mi analito?”
“Al observar la estructura del analito, ¿cómo determino la columna que debo utilizar?”
“Necesito una columna quiral de fase inversa para separar X: ¿me pueden recomendar una?”
Por desgracia, no hay una respuesta a estas preguntas que aparezca en los libros.
En resumen, la respuesta es “si la vida fuera así de sencilla”. Las separaciones cromatográficas se producen cuando una combinación de fase estacionaria y fase móvil proporciona un entorno en el que se puede expresar la selectividad entre analitos con diferentes propiedades químicas. En la cromatografía de fase inversa, por ejemplo, los analitos se retienen hidrofóbicamente por la fase estacionaria, y luego se eluyen en orden de hidrofobicidad creciente. Cuando se trata de enantiómeros, las propiedades químicas y físicas son idénticas y, por lo tanto, se requiere alguna forma de reconocimiento quiral para lograr una separación.
El mecanismo para realizar separaciones quirales implica la formación de un complejo diastereomérico, ya sea entre un aditivo de la fase móvil y el analito de interés, o entre la fase estacionaria y el analito. Una vez formados, es posible separar los enantiómeros, ya sea porque el complejo diastereomérico tiene propiedades diferentes, o debido a la estabilidad del complejo formado, reteniéndose preferentemente un enantiómero sobre el otro. El uso de modificadores quirales en la fase móvil, aunque es posible, generalmente no se adopta en la HPLC (aunque se utiliza en la electroforesis capilar), ya que el coste de tales aditivos hace que esta opción sea económicamente inviable en la mayoría de los casos. Los tipos de fase estacionaria quiral utilizados a lo largo de los años incluyen los siguientes:
- Fases de Pirkle: las fases totalmente sintéticas basadas en aminoácidos funcionalizados, proporcionan un reconocimiento quiral al ofrecer 3 puntos de interacción. Los materiales suelen estar pegados, por lo que la robustez es buena. Este tipo de fase suele presentar un bajo porcentaje de aciertos, pero ofrece una buena selectividad cuando funciona.
- Fases basadas en la ciclodextrina: fases enlazadas totalmente sintéticas que funcionan según un principio de exclusión en el que un enantiómero puede encajar con mayor precisión dentro de la estructura del “cubo quiral” que el otro.
- Fases basadas en proteínas: las proteínas, como la BSA, se recubren en sílice, ofreciendo una gama más amplia de interacciones quirales, la resolución quizás no sea tan buena como la de las fases Pirkle o ciclodextrina, pero estas columnas ofrecen una gama más amplia de selectividad. Hay que tener cuidado con las fases de base proteica para no contaminar la fase, o para no lavarla del soporte de sílice durante su uso.
- Intercambio de ligando: el mecanismo de intercambio de ligando utiliza la penicilamina en combinación con una fase móvil que contiene iones de cobre II de forma relativamente específica. Los iones forman complejos con los aminoácidos que permiten separarlos.
- Fases estacionarias de las bases de polisacáridos: se basan en los polímeros quirales naturales de la celulosa o la amilosa. Los polímeros se derivan para proporcionar interacciones adicionales. Dependiendo de los disolventes utilizados, los polímeros se hinchan en diferentes grados, lo que crea “bolsas quirales” dentro de la estructura, permitiendo que los analitos entren y salgan para efectuar la separación. Los últimos avances en este sentido han incluido la inmovilización de dichas fases, lo que permite utilizar una gama de disolventes más amplia que la que se podía utilizar anteriormente. Se pueden utilizar disolventes como el DMSO y el DMF, lo que puede ser útil cuando se consideran separaciones preparatorias en las que la solubilidad del analito puede presentar dificultad.
Dada la flexibilidad que ofrecen las fases de polisacáridos, que permiten realizar separaciones en fase normal, fase inversa, orgánicas polares y SFC con gran eficacia, estas fases se convirtieron en la columna elegida por muchos usuarios que realizan separaciones quirales. Las fases ofrecen altas tasas de aciertos, lo que a su vez aumenta la probabilidad de encontrar un conjunto de condiciones que proporcionen una separación efectiva.
Debido al carácter complejo de las interacciones entre los enantiómeros y una fase estacionaria quiral, no es posible predecir con exactitud qué fase estacionaria proporcionará una buena separación. Por lo tanto, es necesario examinar diferentes composiciones de la fase estacionaria y de la fase móvil con el fin de probar la mejor combinación para su uso en una separación. En el cribado de nuestra gama de fases de polisacáridos, Lux®, cribamos los 3 modos: fase normal, fase inversa y modo orgánico polar en tándem. Las columnas Lux también pueden utilizarse con éxito en condiciones de SFC si los usuarios tienen acceso a esta tecnología. Cribamos las siguientes fases:
- Lux celulosa-1
- Lux celulosa-2
- Lux celulosa-3
- Lux i-amilosa-3
- Lux i-celulosa-5
- Lux amilosa-1
- Lux i-Amilosa-1
El cribado también puede realizarse en condiciones favorables a la LC-MS únicamente si es necesario.
Los detalles precisos del cribado se pueden encontrar viendo este póster: Estrategias simplificadas de cribado de columnas de HPLC/SFC quirales
Una vez que se complete el cribado, es necesario revisar los resultados obtenidos, tomando los más prometedores para optimizarlos si es necesario. Se comprobó que ésta es la forma más eficaz de desarrollar separaciones quirales con buena resolución y robustez.
Los clientes interesados en utilizar nuestro servicio de cribado quiral deben ponerse en contacto con su oficina local de Phenomenex, o bien contactarse con nosotros a través de nuestra página web. También podemos asesorarlo sobre las columnas adecuadas para el cribado si desea realizar su propio cribado en la empresa.
¿Tiene alguna otra pregunta sobre el cribado quiral u otras consultas sobre la optimización de métodos? Chatee con uno de nuestros especialistas técnicos a través de nuestro servicio de chat en línea, Chatear ahora, casi 24/7 en todo el mundo.
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