Descargar PDF

La cromatografía líquida depende de una fase móvil hecha con precisión. Muchos de los problemas cromatográficos se pueden atribuir a una fase móvil que no se preparó correctamente. La contaminación debida a aditivos de la fase móvil deteriorados o de mala calidad, el desplazamiento de los picos a causa de una fase móvil mal tamponada y los tiempos de retención incorrectos al intentar replicar la Monografía son algunos de los problemas que pueden surgir. En esta publicación, analizaré los componentes principales y los pasos a seguir para realizar una fase móvil exitosa y culminaré proporcionando un procedimiento de preparación de fase móvil tamponada.

Todo sobre los reagentes

Si añades algo incorrecto, obtendrás también algo incorrecto. Cuando prepare una fase móvil para LC, deberá empezar con el grado correcto de solvente para su sistema. Si se utiliza un HPLC, se tratará de un disolvente de grado HPLC, como el metanol o el acetonitrilo; si se utiliza un espectrómetro de masas, habrá que elegir un grado aún mayor. El agua deberá proceder de una botella con el grado de disolvente adecuado o de un sistema de filtración MilliQ. Una vez abierta la botella de agua, debe asignarse una fecha de caducidad de una semana para garantizar que no pase el tiempo suficiente para que se formen microbios en la botella abierta. En el caso de las fuentes de agua MilliQ, asegúrese de que los filtros y las membranas se sustituyen como parte del mantenimiento preventivo para no permitir que entre agua de mala calidad en el sistema LC.

Cualquier producto químico que se añada debe ser también de la calidad correcta. Para estos es vital que no estén vencidos. Los degradantes de los aditivos vencidos pueden ser la identidad de los picos desconocidos en el cromatograma en blanco. Algunos aditivos pueden estropearse antes de la fecha de vencimiento que figura en la botella una vez abierta, lo que debería investigarse durante la resolución de problemas de picos desconocidos. Un alto porcentaje de orgánico puede sacar impurezas en un disolvente de menor grado que pueden parecer impurezas de la muestra. La realización de un blanco de su matriz de muestras permitirá tenerlas en cuenta. El uso del grado correcto de disolventes minimizará estas contaminaciones y prolongará la vida útil de su columna de LC.

Todo sobre el pH

Los tampones tienen la capacidad de mantener la fase móvil a un pH constante incluso si se añade un poco más de ácido o base al sistema. La hidrofobicidad es un término utilizado para describir si un compuesto favorece más al agua o a lo orgánico. El LogP, o coeficiente de partición, es una medida de la solubilidad de un compuesto en dos disolventes inmiscibles, normalmente se utilizan el octanol y el agua. El LogP de un compuesto se ve afectado por el pH, es decir, el comportamiento hidrofóbico de un compuesto puede depender del pH al que se ejecute en el método. Un pH más bajo o más alto podría cambiar la retención de un compuesto. Si se prepara una fase móvil con un pH diferente, el tiempo de retención puede cambiar para los compuestos sensibles al pH.

El pH de la fase móvil también puede influir en la clase del compuesto. En el caso de los compuestos ionizables, esto puede significar la diferencia entre un buen pico único o un pico dividido en el que están presentes dos formas diferentes al mismo tiempo.

Nota del autor: una herramienta útil que he utilizado en el pasado es www.chemicalize.com para los cálculos químicos, la búsqueda y la conversión nombre-estructura.

Dos aditivos de fase móvil habituales en los tampones de LC son el fosfato y el acetato. El ácido fosfórico tiene tres pKa: 2.15, 7.20 y 12.33. La capacidad amortiguadora será de ± 1 unidad de pH a partir del pKa del aditivo, lo que significa que los 3 rangos de amortiguación para el fosfato serán 1.15-3.15, 6.20-8.20 y 11.33-13.33. Por ejemplo, si se le da un pH de 5, un tampón de fosfato perderá su capacidad de amortiguación y ya no podrá mantener un pH para un compuesto ionizable.

Al preparar una fase móvil tamponada o con pH, mezcle primero el aditivo con el agua y luego el pH con el contraión. Ejemplos de los contraiones apropiados para usar para el fosfato de potasio serían el ácido fosfórico para bajar el pH o el hidróxido de potasio para elevar el pH. Es importante no añadir el orgánico antes de la determinación del pH, ya que esto provocará que la lectura del pH sea incorrecta y que la fase móvil esté preparada de forma incorrecta. El orgánico debe añadirse después de haber alcanzado el pH adecuado para la solución acuosa.  

Todo sobre la filtración

Una vez que la fase móvil está bien mezclada, el último paso de la preparación es el filtrado. Para este paso se puede utilizar un sistema de filtración de vidrio al vacío, como el que se muestra a continuación. Los filtros de fase móvil vienen en diferentes tipos de membranas y deben elegirse en función de los disolventes que se van a filtrar. Las membranas de celulosa regenerada (RC) se utilizan habitualmente para los métodos de fase inversa, ya que su naturaleza hidrofílica es buena para los disolventes acuosos. Para los sistemas de HPLC debe utilizarse un tamaño de poro de al menos 0.45 um, mientras que para los sistemas de UHPLC se considera 0.20 um. Este paso elimina cualquier partícula sobrante de la preparación de la fase móvil para ayudar a evitar que el sistema y la columna se obstruyan.


¿Tiene alguna pregunta sobre lo expuesto anteriormente? Póngase en contacto con Genevieve o con otro de nuestros expertos técnicos a través del chat en vivo en cualquier momento del día con tiempos de respuesta rápidos. Converse hoy mismo en www.phenomenex.com/chat

Leave a Reply

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.